FluorCam多光譜熒光成像技術應用案例——植物病害表型研究

1. 植物病害早期快速無損檢測

由于次生代謝產物如多酚等與植物的病害脅迫應答機制緊密相關。因此初，FluorCam多光譜熒光成像技術主要用于植物病害早期快速無損檢測，希望能在病害產生嚴重影響前就能發現感染（圖4）。                 圖1. UV-MCF多光譜熒光成像早期研究，左：煙草花葉病毒感染的多光譜熒光連續觀測（Chaerle，2006）；右：辣椒輕斑駁病毒感染早期的多光譜熒光分析（Pineda，2008）

隨著研究的不斷深入，科學家們將多光譜熒光成像與葉綠素熒光成像、紅外熱成像、以NDVI歸一化植被指數為代表的反射光譜成像等其他表型分析技術結合，開展了更深入的植物病害檢測和表型研究工作。

德國萊布尼茨蔬菜和觀賞植物研究所IGZ致力于通過這些成像分析技術發展一種能夠高通量快速檢測生物脅迫的方法。他們使用了一種模式植物-病原體系統生菜-立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），希望通過這幾種技術獲得的數據能夠快速將受到生物脅迫和未受到脅迫的植株區分開（Sandmann，2017）。

圖2. 生菜-立枯絲核菌的NDVI成像圖與熱成像圖

由于這幾種技術的原理不盡相同，類似的研究中經常需要使用多種儀器才能完成。而FluorCam多光譜熒光成像系統是目前*有能力實現了一臺儀器上同時完成葉綠素熒光、多光譜熒光、NDVI歸一化植被指數以及GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等熒光蛋白與熒光染料的成像分析功能，加裝熱成像模塊后還可以進行熱成像分析。這些功能使得FluorCam多光譜熒光成像系統就成為了一套功能非常全面的植物病害表型研究系統。

通過數據分析終發現葉綠素熒光參數：PSII大量子產額Fv/Fm和熒光衰減比率Rfd的區分效果好，誤差≤0.052。研究者希望通過進一步工作，將這一發現應用于園藝和農業生產實踐。

圖3. FluorCam多光譜熒光成像系統測量的各項表型參數及分析數據結果

2. 葉片病害

細菌性軟腐病菌Dickeya dadantii是農業上的重要病害。這種病菌會先圍繞一個萎黃環出現多個壞死斑點，進而整個感染區域壞死并逐漸擴展到周圍的組織中。FluorCam葉綠素熒光成像、FluorCam多光譜熒光成像、熱成像可以在時間和空間尺度上分別反映細菌感染對光合作用、初級和次級代謝和氣孔活性的影響。西班牙國家研究委員會（CSIC）使用這三種技術對甜瓜葉感染Dickeya dadantii進行了成像測量，同時通過機器學習來處理這些成像技術獲得的數據，建立數學算法來分類葉片感染區域（Pineda, 2018）。

圖4. 甜瓜葉感染Dickeya dadantii不同時期的葉綠素熒光成像、多光譜熒光成像和熱成像圖

根據成像圖獲得的葉綠素熒光和多光譜熒光定量數據

除病毒和細菌外，真菌引起的植物葉片病害也有廣泛的研究，比如由真菌Podosphaera fusc感染引起的白粉病。通過對感染白粉病的西葫蘆葉片進行FluorCam多光譜熒光和熱成像分析，發現多光譜熒光參數F520/F680對于識別白粉病特別靈敏。這也證明了多光譜熒光非常適用于類似的植物表型研究（Pineda, 2017）。

圖5. 感染白粉病的西葫蘆葉片：（a）RGB成像；（b）熱成像；（c）多光譜熒光F440成像；（d）多光譜熒光F520/F680成像

3. 根系病害

由于根系難以直接觀察和檢測，因此根系病害具有一定的隱蔽性。往往在發現病害時，其癥狀已經發展到中后期。鱷梨根系感染白紋羽病Rosellinia necatrix后，通過葉片的葉綠素熒光成像、多光譜熒光成像、熱成像分析，發現病害造成的根系功能損失，能夠同步影響葉片的光合生理、次生代謝和氣孔功能。而葉綠素熒光參數甚至可以在癥狀發展前就指示出病害的發生。通過FluorCam多光譜熒光成像技術進行的這一研究既發現了根系病害對植物整體生理功能和地上部表型的影響，也為根系病害提供了早期檢測工具（Granum, 2015）。

圖6. 感染白紋羽病的鱷梨：左：地上部RGB圖；右：葉綠素熒光、多光譜熒光與熱成像圖

4. 種子病害

間座殼屬Diaporthe/擬莖點霉屬Phomopsis病原菌復合體是一類大豆種傳性病原體。它會首先感染大豆種子并以休眠菌絲的形態存活。而隨著大豆的萌發和生長，它就會造成大豆種腐病等嚴重病害。

阿根廷布宜諾斯艾利斯大學嘗試使用不同的非熱等離子體Non-thermal plasma處理間座殼屬Diaporthe/擬莖點霉屬Phomopsis病原菌復合體侵染的大豆種子，然后對種子萌發和營養生長狀況進行評估，從而確定這種種子病害消毒方法是否理想——既能控制病害，又不會對大豆的營養生長造成不利影響。FluorCam葉綠素熒光、FluorCam多光譜熒光成像、熱成像等都為這一研究提供的重要的數據。實驗結果發現，非熱等離子體處理后的感染大豆，其光合能力與健康植株基本相同。而比起未進行處理的大豆，其生長狀況甚至有所提高（Pérez-Pizá, 2019）。

圖7. 左：不同感染狀況和處理后的大豆幼苗；右：大豆的RGB成像、熱成像、多光譜熒光成像

參考文獻：

1. Chaerle L, et al. 2006, Multi-color ?uorescence imaging for early detection of the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus, Journal of Plant Physiology, doi:10.1016/j.jplph.2006.01.011

2. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060

3. Sandmann M, et al. 2017. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease, doi: 10.1094/PDIS-10-17-1536-RE

4. Pineda M, et al. 2018. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data. Front. Plant Sci. 9(164), doi: 10.3389/fpls.2018.00164

5. Pérez-Pizá MC, et al. 2019. Improvement of growth and yield of soybean plants through the application of non-thermal plasmas to seeds with different health status. Heliyon 5: e01495

6. Granum E, et al. 2015. Metabolic responses of avocado plants to stress induced by Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur J Plant Pathol, DOI 10.1007/s10658-015-0640-9

7. Pineda M, et al. 2017. Use of multicolour fluorescence imaging for diagnosis of bacterial and fungal infection on zucchini by implementing machine learning. Functional Plant Biology

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